Next Generation Sequencing, was ist das?
Die Didesoxymethode nach Sanger war ein Durchbruch beim Sequenzieren von DNA. Dennoch erforderte sie viel Zeit und war umständlich. Inzwischen wurden weitere Verfahren entwickelt, die es ermöglichen, wesentlich schneller zu sequenzieren. Normalerweise werden sie unter dem Begriff “next generation sequencing” zusammengefasst. Dabei geht ein verringerter Arbeitsaufwand nicht automatisch mit geringeren Kosten einher. So wurde das erste Verfahren, das als DNA-Sequenzierung der zweiten Generation gelten kann , bereits 1992 von Lynx Therapeutics entwickelt. Das Verfahren gelang aufgrund der Komplexität der Technik nie zur Serienreife.
Zu den bekanntesten unter den neuen Methoden zählt die Pyrosequenzierung. Die Besonderheit ist das Zusetzen einer Luciferase, die Biolumineszenz beim Einbauen der Basen hervorruft. Dies geschieht dadurch, dass durch den Einbau des Nukleotids in den Strang von der DNA-Polymerase Pyrophosphat umgesetzt wird. Dieses reagiert wiederum durch die ebenfalls hinzugegebene ATP-Sulfurylase zu ATP, also der Energiewährung der Zelle. Das ATP wird von der Luziferase benötigt um Luziferin in Oxyluziferin umzusetzen, wobei der Lichtblitz entsteht. Dieser wird von einem Detektor erfasst. Da die DNA-Polymerase gewissermaßen “bei ihrer Arbeit” beobachtet wird, kann man so darauf schließen, an welcher Stelle das Nukleotid eingebaut wurde. Der Ansatz enthält dabei jeweils nur ein Nukleosidtriphosphat. Anschließend werden die verbleibenden NTPs vernichtet und eine neue Art hinzugesetzt.
Zusätzlich gibt es noch zahlreiche weitere neue Methoden des „next generation sequencing“, wobei den meisten gemeinsam ist, dass sie zum einen eine Parallelisierung von Synthese und Sequenzierung und zum anderen eine Miniaturisierung anstreben. Auf diese Weise wird nicht nur der Zeitaufwand, sondern vor allem auch der Materialaufwand verringert. Nukleotide zu markieren ist sehr kostenintensiv, sodass vor allem an dieser Stelle das Einsparpotenzial genutzt werden soll. Inzwischen sind die Methoden der zweiten Generation fast schon wieder veraltet. Innerhalb der nächsten zwei Jahre sollen neue Instrumente auf den Markt kommen, die auf Einzel-Molekül-Basis sequenzieren und somit noch preiswerter und schneller sind.